2020 分子诊断技术(韩山师范学院) 最新满分章节测试答案

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本课程起止时间为:2020-03-02到2020-07-26
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第二章 免疫印迹法测定P-glycoprotein的蛋白表达 单元测验：第二章 免疫印迹法测定P-glycoprotein的蛋白表达

1、 问题:免疫印迹技术属于（     ）。
选项：
A:双向免疫扩散
B:对流免疫电泳
C:固相免疫电泳
D:膜载体酶免疫技术
E:荧光免疫技术
答案: 【膜载体酶免疫技术】

2、 问题:有关免疫印迹技术错误的是（    ）。
选项：
A:抗原需先进行SDS-PAGE分离
B:需应用特异性抗体
C:抗原无需进行SDS-PAGE分离
D:鉴定蛋白质的敏感性为1-5ng
答案: 【抗原无需进行SDS-PAGE分离】

3、 问题:与抗原抗体的特异性有关的是（    ）。
选项：
A:抗原抗体结构的互补性
B:抗原决定基的种类
C:抗体的效价
D:抗原分子的抗原决定基数量
E:抗原抗体的分子比例
答案: 【抗原抗体结构的互补性】

4、 问题:关于聚丙烯酰胺凝胶电泳，下列说法正确的是（    ）。
选项：
A:该凝胶机械强度差
B:其凝胶孔大小不可调节
C:有电渗作用
D:是区带电泳的一种
E:不能分离核酸
答案: 【是区带电泳的一种】

5、 问题:关于SDS-PAGE的描述，错误的是（    ）。
选项：
A:凝胶介质形成立体多孔网状结构
B:具有分子筛和电泳作用
C:用于蛋白分离
D:丙烯酰胺浓度越大，线性分离范围越小
E:小分子量蛋白离负极近
答案: 【小分子量蛋白离负极近】

6、 问题:免疫印迹又称蛋白质印迹，是根据                                                         检测复杂样品中的某种蛋白的方法。
答案: 【抗原抗体的特异性结合】

7、 问题:十二烷基硫酸钠（SDS）是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的                    ，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。
答案: 【氢键】

8、 问题:免疫印迹显色的方法主要哪几种： 放射自显影 、底物化学发光ECL、底物荧光ECF 、底物DAB呈色，最常用的是                                     。
答案: 【底物化学发光ECL】

9、 问题:在Western blotting实验中加封闭液的作用是                               ，否则经底物显色反应后，整个NC膜都会背上色，无从辨别实验蛋白。
答案: 【防止抗体非特异性结合】

10、 问题:SDS-PAGE一般采用的是                         缓冲系统，能够有较高的分辨率。
答案: 【不连续】

11、 问题:聚丙烯酰氨凝胶电泳催化聚合的常用方法有两种：化学聚合法和光聚合法。化学聚合以 过硫酸铵（APS） 为催化剂，以                                    为加速剂。
答案: 【(以下答案任选其一都对)四甲基乙二胺;
TEMED】

12、 问题:丽春红带负电荷，可以与带正电荷的氨基酸残基结合，同时丽春红也可以与蛋白质的                                   相结合，从而形成红色的条带。
答案: 【非极性区】

13、 问题:为了防止微生物污染，                           经常被加入到抗体中（终浓度0.02% (w/v)）。
答案: 【(以下答案任选其一都对)NaN3;
叠氮化钠】

14、 问题:BCA法是在                   下蛋白质与 Cu2+ 络合，并将 Cu2+ 还原成 Cu+，Cu+ 和独特的BCA Solution A（含有BCA）相互作用产生敏感的颜色反应。两分子的BCA螯合一个铜离子，形成紫色的反应复合物。
答案: 【碱性环境】

15、 问题:免疫印迹实验必须引入校正内参，如看家基因                         、β-actin 或 β-tubulin 等。
答案: 【(以下答案任选其一都对)GAPDH;
甘油醛-3-磷酸脱氢酶】

16、 问题:SDS 是一种阴离子表面活性剂，加入到电泳系统中能使蛋白质的氢键和                                打开，并结合到蛋白质分子上。
答案: 【疏水键】

17、 问题:如果抗体要用来标记的话，则不能加入                 ，因为该物质会和抗体一起竞争结合标记物。
答案: 【蛋白稳定剂】

18、 问题:电转印膜常用的有NC膜和PVDF膜，其中                      使用前需在甲醇中浸泡活化。
答案: 【PVDF膜】

19、 问题:二抗是在其他宿主体内制备的能与一抗或一抗片段结合的抗体，偶联到二抗上的探针主要有酶、荧光基团和                     。
答案: 【生物素】

20、 问题:一般二抗上偶联的酶有                                               和碱性磷酸酶（AP；或其衍生物APAAP，PAP）等。 偶联的荧光基团有异硫氰酸荧光素（FITC）、若丹明红-X（RRX）、德克萨斯红（TR）、藻红蛋白（PE）等。
答案: 【(以下答案任选其一都对)辣根过氧化物酶;
HRP】

21、 问题:                              对 HRP 有灭活作用，在 HRP 检测系统中应当禁用该物质。
答案: 【(以下答案任选其一都对)叠氮化钠;
NaN3】

【作业】第二章 免疫印迹法测定P-glycoprotein的蛋白表达 单元作业：第二章 免疫印迹法测定P-glycoprotein的蛋白表达

1、 问题:免疫印迹分析中SDS-PAGE电泳使用预染蛋白标准品的优点有哪些？作用是什么？
评分规则: 【 预染蛋白标准品由发色团或染料与蛋白结合的彩色条带组成（1分），具有锐利且稳定的颜色呈彩色（1分），易于凝胶中示踪（1分），即用型上样（1分），无需煮沸（1分） ，稀释或添加还原剂（1分），转膜效果好（1分）。可应用于实时监控SDS-PAGE中的蛋白迁移（1分），检验Western转膜效率（1分），对蛋白大小进行粗略鉴定（1分）。
】

2、 问题:免疫印迹条带太多，背景强度低于条带的原因是什么？有何解决的方案？
评分规则: 【 免疫印迹条带信号非常强，难以分辨，背景虽然也比较脏，但低于条带强度。出现这种情况可能是因为一抗的浓度过高（1分），一抗的特异性不好（1分），或是样品的丰度太高（1分）。可以通过降低一抗的浓度（1分），更换特异性更好的一抗（1分），或是减少样品的上样量进行改善（1分）。注意一抗特异性引起的问题往往更难解决。如果抗体本身的特异性不够好，一般很难得到背景干净的显色结果。
】

3、 问题:电转印不成功的原因有哪些？解决的方法有哪些？
评分规则: 【 ①　转印时间过短。解决方法：厚的凝胶需要更长的转印时间，可适当延长转印时间。（1分）②　电源条件不适当。解决方法：转印开始前核实电流。在特定电压下，电流可能很低；如果缓冲液使用不当，导电性会很低，在转印膜上将产生很小的电场强度；更换缓冲液或增加电压设定值；尝试高电场强度转印；核实电源最高的电流值；如果使用的电源不合适，当电流达最高限定条件时，还未到所设定的电压。（1分）③　蛋白转印穿透印迹膜。解决方法：如果印迹膜功率条件设定太高或转印时间过长，蛋白会穿过膜并转印到滤纸上；调整转膜功率和转印时间。（1分）④　蛋白转印方向相反。解决方法：核实凝胶/印迹膜三明治结构组装顺序相反或放入相反的电极板间；核实电源线的电极是否接反。（1分）⑤　检测系统失灵或灵敏度太低。解决方法：加入适当的阴、阳性抗原对照试剂以检测试剂盒的灵敏度，详见各种试剂盒的说明书；转印后用考马斯亮蓝染色试剂对转印后的凝胶进行全蛋白染色，检测是否全部转印。（1分）⑥　错误的电荷质量比（非变性转印）。解决方法：使用更酸或更碱性的缓冲液增加转印效率；蛋白在它们的等电点附近不能全部转印，缓冲液的pH值应该比靶蛋白的等电点低或高2个pH值。（1分）⑦　蛋白在凝胶中有沉淀。解决方法：在缓冲液加入少量的SDS。SDS可以提高转印效率，但同时又会引起蛋白与硝酸纤维素印迹膜结合力的下降以及影响蛋白与抗体的活性；消除或降低转印缓冲液中乙醇的含量。（1分）⑧　缓冲液中的甲醇对蛋白转印效率和膜结合力的影响。解决方法：降低甲醇的含量，可以提高蛋白的转印效率；同时却降低了蛋白与硝酸纤维素印迹膜的结合力；通常使用量为20%甲醇。（1分）⑨　电源线路故障或电源使用不当。解决方法：检查保险丝，确保电源输出电压和电流与转印的需要相符合；检查电源输出功率。（1分）⑩　凝胶浓度过高。解决方法：降低凝胶浓度，增大孔径，可以提高转印效率。（1分）
】

4、 问题:蛋白与硝酸纤维素印迹膜结合较弱的原因有哪些？如何解决？
评分规则: 【 ①　缓冲液中甲醇含量未优化。（1分）解决方法：核实电转印缓冲液中甲醇的用量，通常优化使用甲醇为20%。（1分）②　蛋白转印穿透硝酸纤维素印迹膜。（1分）解决方法：使用PVDF或0.2µm硝酸纤维素印迹膜（小孔径）；如果使用高电场强度转印方法，应适当降低电压设定值；在三明治结构中再附加一张硝酸纤维素印迹膜，用来观察蛋白是否穿透第一张膜。（1分）③　小于15kDa的蛋白与0.45µm硝酸纤维素印迹膜结合率较低，同时也容易被洗脱掉。（1分）解决方法：使用PVDF或尼龙膜，蛋白与它们的结合力较高；使用 0.2µm硝酸纤维素印迹膜；在清洗和抗体孵育时使用表面活性剂Tween 20；减少或不要使用更苛刻的清洗条件。（1分）④　转印缓冲液中的SDS会降低蛋白的转印结合效率。（1分）解决方法：降低转印缓冲液SDS的含量或不使用SDS。（1分）⑤　印迹膜没有完全润湿或有些干燥。硝酸纤维素膜上的白色斑点表明润湿不完全，仍有干燥部位，蛋白不能与这些干燥部位结合。（1分）解决方法：如果很难润湿，可以将印迹膜放在缓冲液中加热至沸点以下，直至全部润湿，再放入缓冲液中平衡后使用。（1分）⑥　印迹膜和凝胶没有密切接触，在二者之间存有气泡或过量缓冲液。（1分）解决方法：使用滚筒小心地在多个方向上来回滚动，以驱赶印迹膜与凝胶间的气泡或过量缓冲液；在凝胶和印迹膜两侧使用更厚的滤纸；更换纤维衬垫，衬垫会随时间压缩或失效，不能夹紧印迹膜和凝胶。（1分）
】

5、 问题:免疫检测高背景的原因有哪些？如何解决？
评分规则: 【 ①　封闭不完全。解决方法：封闭液要与印迹膜的类型相匹配；例如封闭 PVDF膜需要使用应用广泛的脱脂牛奶，按需要量增加封闭液的浓度和封闭时间；封闭液必须是一个纯蛋白；封闭液通常会被与探针非特异结合的物质所污染。（1分）②　清洗不充分。解决方法：增加清洗次数、时间以及清洗剂的去污力；在清洗时加入少量表面活性剂如SDS比NP-40的去污力强，NP-40比Tween-20强；在抗体缓冲液中加入Tween-20会降低非特异结合。（1分）③　印迹膜在底物溶液中放置时间过长。解决方法：当信噪比较得当时，取出印迹膜；反应时间不宜过长，并立即置于ddH2O中终止反应。（1分）④　电泳或转印过程中污染。解决方法：重新更换凝胶和转印缓冲液；更换或彻底清洗转印槽中污染的纤维衬垫。（1分）⑤　凝胶上的蛋白样品过载或在转印缓冲液中使用了过多的SDS，蛋白直接穿透印迹膜并在转印体系中循环而不能结合在印迹膜上。解决方法：降低蛋白的上样量或降低缓冲液中的SDS，再附加一张膜以结合过量蛋白。（1分）⑥　一级或二级抗体浓度过高。解决方法：增加抗体稀释倍数，采用斑点印迹技术筛选合适的浓度。（1分）⑦　孵育槽被污染。解决方法：清洗孵育槽或使用一次性孵育槽。（1分）
】

6、 问题:免疫印迹实验无反应信号或反应信号弱的原因有哪些？如何解决?
评分规则: 【 ①　样品的上样量过低。解决方法：增加蛋白的上样量；上样前浓缩样品；使用灵敏度更高的检测体系。（1分）②　抗原与印迹膜结合不充分。解决方法：转印后对凝胶进行染色，或使用预染标准品检测转印效率。（1分）③　电泳或电转印过程中抗原发生了变性。解决方法：抗体，尤其是单抗，可能不能识别已变性的抗原；在非变性条件下电泳或转印蛋白；在转印热敏感蛋白时应使用超级冷芯和冷循环或其他冷却设备。（1分）④　一级或二级抗体失活或非饱和使用。解决方法：在适宜的条件下保存试剂。应避免反复冻融、细菌污染以及加热失活；表面活性剂影响某些抗体的结合，在封闭后应尽量清洗干净，除非是清洗后封闭；如果抗体滴度很低，可使用斑点印迹技术对其浓度进行优化；延长抗体孵育时间。（1分）⑤　酶联结合物失活或处于非饱和状态。解决方法：测试试剂活性；在适宜的条件下保存试剂。应避免反复冻融、细菌污染以及加热失活；叠氮化钠阻碍辣根过氧化物酶的活性，而汞硫代水杨酸钠可以抑制细菌；未蒸馏的水会使酶失活，使用双蒸水或去离子水；如果耦联体浓度过低，请使用斑点印迹技术优化。（1分）⑥　显色反应试剂失活。解决方法：测试试剂的活性，如需要请重新配制。（1分）
】

7、 问题:靶蛋白和探针之间非特异反应的可能原因有哪些？如何解决？
评分规则: 【 ①　一级或二级抗体被非特异IgG污染，或两个种属间IgG交叉反应。解决方法：使用纯化的IgG一级抗体片断和亲和纯化后的印记级二级抗体。（2分）②　单克隆抗体与被SDS变性了的蛋白发生了非特异性反应。解决方法：比较其它单克隆或多克隆抗体与天然蛋白结合的强弱；转印非变性蛋白作为比较。（2分）③　离子引起了非特异相互作用，例如生物素、羰基化蛋白在印迹膜上结合了更酸性的蛋白。解决方法：提高温育缓冲液的离子强度；增加清洗次数、时间以及清洗剂的去污力；在清洗时加入少量表面活性剂如SDS比NP-40的去污力强，NP-40比Tween-20强；在抗体缓冲液中加入Tween-20会降低非特异结合。（2分）
】

【作业】第一章 实时荧光定量PCR检测P-glycoprotein的基因表达 单元作业：第一章 实时荧光定量PCR检测P-glycoprotein的基因表达

1、 问题:荧光定量PCR注意事项有哪些？
评分规则: 【 ①在实验过程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。在总RNA的提取过程中，注意避免mRNA的断裂。（2分）②为了防止非特异性扩增，必须设阴性对照。（2分）③内参的设定:主要为了用于靶RNA的定量。常用的内参有G3PD(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)、β-Actin(β-肌动蛋白)等。其目的在于避免RNA定量误差、加样误差以及各PCR反应体系中扩增效率不均一各孔间的温度差等所造成的误差。（2分）④PCR不能进入平台期，出现平台效应，与所扩增的目的基因的长度、序列、二级结构以及目标DNA起始的数量有关。故对于每一个目标序列出现平台效应的循环数，均应通过单独实验来确定。（2分）⑤防止DNA的污染：采用DNA酶处理RNA样品。在可能的情况下，将PCR引物置于基因的不同外显子，以消除基因和mRNA的共线性。（2分）
】

2、 问题:请简述什么是UDG（尿嘧啶-DNA糖基化酶）？
评分规则: 【 碱基对，是形成DNA、RNA单体以及编码遗传信息的化学结构。如果有某一对碱基对的排列错误而导致基因编码异常，就很有可能引发癌症等疾病。可是，很多动物的DNA分子链中有数以亿计的碱基对，想从中找到错误的一条就无异于大海捞针。（3分）美国的研究人员发现，有一种细胞酶可自动检验碱基对排列的对错。这就是UDG酶。美国约翰斯·霍普金斯大学医学院的研究人员报告说，他们通过实验发现，动物细胞中的一种UDG酶可以抓取DNA分子链中的基对并用特定形状的"口袋"来进行检查，如果碱基对排列形状正确则将其放回原处，如果形状有误则将其清除，DNA分子链中留下的空白会由其他修复机制来修补。（3分）
】

第一章 实时荧光定量PCR检测P-glycoprotein的基因表达 单元测验：第一章 实时荧光定量PCR检测P-glycoprotein的基因表达

1、 问题:                          是以PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，一般荧光域值定义为3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。
答案: 【荧光域值】

2、 问题:CT值，也称                                ，C代表Cycle，t代表threshold，是指在PCR循环过程中，荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数。
答案: 【循环阈值】

3、 问题:一个哺乳动物细胞RNA中，大概80%-85%是                                      ，15%-20%由不同低相对分子质量的RNA组成，包括rRNA和tRNA，而mRNA仅占总RNA的1%-5%。
答案: 【核糖体RNA】

4、 问题:核苷酸及衍生物具有                        具有紫外吸收效果。
答案: 【共轭双键】

5、 问题:TRIZOL试剂的主要成分是异硫氰酸胍和苯酚，其中，                                           能使细胞裂解，促使核蛋白体的解离，使RNA与蛋白质分离，并将RNA释放到溶液中。
答案: 【异硫氰酸胍】

6、 问题:实时荧光定量 PCR 常用的检测模式有                                   和SYBR Green I 检测模式。
答案: 【TaqMan探针】

7、 问题:RNA得率低的原因有样品裂解或匀浆处理不彻底，或                                                       等。
答案: 【RNA沉淀未完全溶解】

8、 问题:A280nm是蛋白和酚类物质最高吸收峰的吸收波长，比值可进行核酸样品纯度评估:纯DNA的A260/A280比值为1.8，纯RNA为                    。如果比值低，表示受到蛋白(芳香族)或酚类物质的污染，需要纯化样品。
答案: 【2.0】

9、 问题:A230nm是碳水化合物最高吸收峰的吸收波长，比值可进行核酸样品纯度评估:纯DNA和 RNA的A260/A230比值为                          。若比值小于2.0表明样品被碳水化合物(糖类)、盐类或有机溶剂污染，需要纯化样品。A230产生负值主要是由于在很低DNA 浓度的溶液中的一些其他成分的干扰所导致的。在下一个测定中，需要降低样品的稀释度，A230的负值会被校正。
答案: 【2.5】

10、 问题:A320nm或A340nm为检测溶液样品的浊度和其他干扰因子，该值应该接近                  。如果不是，表明溶液中有悬浮物，需要纯化样品。
答案: 【0】

11、 问题:DEPC是RNA酶的化学修饰剂,它和RNA酶的活性基团组氨酸的                        反应而抑制酶活性。
答案: 【咪唑环】

12、 问题:Taqman探针的5’端常用荧光基团                           标记，最佳激发光波长：494-495nm，最大发射光波长：518-520nm。
答案: 【FAM】

13、 问题:实时荧光定量PCR技术是在PCR反应体系中加入                           ，利用荧光信号的累积实时监测整个PCR进程，并通过分析软件对PCR反应进行检测分析,最后通过标准曲线对未知模板进行总量分析或通过Ct值对模板进行相对定量的一种技术。
答案: 【荧光基团】

14、 问题:                        是指随着实验的进行，扩增产物不断累积，相应的荧光信号也不断在增加，每进行一个循环就采集一次荧光的信号，经过一定的循环数后（一般设置40个循环），就可以得到扩增曲线图，其中横坐标代表扩增的循环数，纵坐标代表荧光强度。
答案: 【扩增曲线】

第三章 PCR与导流杂交技术对人乳头状瘤病毒的分子诊断 单元测验：第三章 PCR与导流杂交技术对人乳头状瘤病毒的分子诊断